DNA-DNA hybridizace
Pod pojmem DNA-DNA hybridizace v tomto textu rozumíme hybridizaci scDNA (single-copy DNA), která probíhá v roztoku (proto se někdy označuje jako „solution DNA-DNA hybridization“).
První studie věnované kinetice hybridizačních reakcí DNA se objevily ve druhé polovině
Bez ohledu na diskuse o jejích výhodách a nevýhodách, i přes stále více expandující aplikační možnosti modernějších molekulárních technik (především sekvencování), patří DNA-DNA hybridizace stále mezi vyhledávané metody, používané při analýze evolučních vztahů mezi organismy. Přestože ji lze použít při studiu jednotlivých sekvencí, celých genů, série několika genů či při srovnávání celých mimojaderných genomů (mtDNA, u rostlin chloroplastová DNA – cpDNA), oblastí její nejčastější aplikace je celý jaderný genom, resp. jeho část, obsahující geny v jediné kopii (single-copy nuclear DNA, scnDNA).
Princip a postup metody
Metoda DNA-DNA hybridizace je založena na denaturaci a reasociaci (renaturaci) dvoušroubovicové DNA (double-stranded, dsDNA). Jestliže dsDNA zahřejeme na 100°C, dojde k rozpojení vodíkových vazeb mezi komplementárními řetězci a ke vzniku jednořetězcové DNA (single-stranded, ssDNA). Následné ochlazení naopak umožní opětovné spojení obou řetězců. Podmínky této reasociace (koncentrace solí, teplota, viskozita, velikost fragmentů) určují rozsah chyb v párování jednotlivých komplementárních nukleotidů: při striktních podmínkách (nízká koncentrace solí, vysoká teplota) je umožněno spojení jen velmi podobných sekvencí; s postupným uvolňováním těchto podmínek (zvyšující se koncentrace solí, snižující se teplota) se mohou párovat i méně podobné sekvence až do chvíle, kdy se mohou náhodně párovat i naprosto odlišné sekvence.
Základní princip metody tkví v tom, že fragmenty DNA dvou různých druhů mohou být smíchány, denaturovány a posléze vzájemně reasociovány za vzniku heteroduplexů. Tyto heteroduplexy vznikají tím hůře (resp. disociují tím snáze), čím jsou oba druhy více evolučně vzdáleny, tj. čím větší jsou rozdíly mezi jejich DNA. Jestliže jsou hybridní molekuly umístěny do teplotního gradientu, můžeme srovnat teplotu tání (melting temperature), tj. teplotu přechodu dvouřetězcových heteroduplexů na jednořetězcové molekuly, s teplotou, při které disociují homoduplexy.
Postup DNA-DNA hybridizace sestává z následujících kroků:
1. Nejdříve je izolována a purifikována dsDNA. Dlouhé řetězce DNA jsou pak rozštěpeny na menší fragmenty (přibližně 500bp) ultrazvukem, nebo mechanicky pomocí homogenizátoru – tím je umožněno oddělení scDNA od repetitivních sekvencí a snížena viskozita. K separaci repetitivní DNA jsou používány speciální reasociační kinetické metody, jejichž výsledkem je stanovení hodnoty C0t, tj. doby inkubace v sekundách, násobené počáteční koncentrací DNA v molech na litr, při které jsou všechny repetitivní sekvence reasociovány a lze je oddělit od jednořetězcové scDNA pomocí chromatografie na hydroxyapatitovém sloupci.
2. Fragmenty scDNA jednoho druhu jsou radioaktivně označeny a hybridizovány s neznačenou DNA téhož druhu (za vzniku homoduplexů) i DNA druhu srovnávaného (za vzniku heteroduplexů). Značená DNA (32P, 3H, 125I) je označována jako izotopový indikátor neboli tracer, neznačená DNA (stejného i odlišného druhu) se nazývá driver (množství driveru musí být mnohonásobně – většinou 1000-10000´ – více než traceru, aby se zamezilo jeho vlastní spontánní reasociaci). Postup značení oligonukleotidových fragmentů je popsán v kapitole „Restrikční analýzy“.
3. Hybridní molekuly jsou nakonec disociovány a z reakce jsou určeny parametry fázového přechodu z dsDNA na ssDNA. Ty umožňují stanovení teploty tání. Rozdíly těchto parametrů pro homo- a heteroduplexy potom slouží jako odhady genetických vzdáleností mezi srovnávanými taxony, které lze použít pro fylogenetické analýzy.
Postup metody si můžeme ilustrovat na příkladu DNA hybridizace s využitím separace na hydroxyapatitovém (HAP) sloupci.